酪蛋白磷酸肽對切除卵巢後老齡 雌性大鼠骨密度的影響
Effsect of Casein Phosphopeptides on the Bone Mineral Density in Aged Ovariectomized Rat
馮鳳琴1，王博誠2，許時嬰3，王璋3，金堅2
（1浙江大學(xué)食品科(kē)學(xué)與營養系，杭州 310029；2江蘇源自醫(yī)學(xué)研究所，無錫 214036；3江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫 214036）
FENG Fengqin1,WANG Bo-cheng2,XU Shi-ying3,WANG Zhang3,JIN Jian2
(1Department of Food Science and Nutrition,Zhejiang University,Hangzhou 310029;
2Jiangsu Institute of Nuclear Medicine,Wixi 214036;
3School of Food Science,Wuxi University of Light Industry,Wuxi 214036,China)
酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides,簡稱CPP)是以牛乳酪蛋白為(wèi)原料,經單一酶或複合酶水解,再經分(fēn)離純化而得到的含有(yǒu)成簇的磷酸絲氨酰基的多(duō)肽。Mykkanen等在正常雞和佝偻病雞上進行了鈣吸收和利用(yòng)試驗，結果表明，CPP能(néng)促進鈣的吸收和利用(yòng)[1]。Sato等也報道，CPP可(kě)促進核素标記的鈣在大鼠股骨中(zhōng)沉積[2]。Tsuchita等證明，CPP可(kě)顯著抑制切除卵巢的老年雌性大鼠股骨的骨密度降低[3]。張亞非等也通過大鼠試驗證明，無論在低鈣飼料還是基礎飼料中(zhōng)，添加一定量的CPP後，可(kě)顯著增加斷乳大鼠對鈣的吸收率和儲留率，但未能(néng)證明鈣的利用(yòng)率有(yǒu)顯著變化[4]。本研究組用(yòng)複合酶-胰酶水解酪蛋白，用(yòng)選擇沉澱法從酪蛋白的酶解液中(zhōng)分(fēn)離CPP，得到了CPP産(chǎn)品，并分(fēn)析測定了其主要組分(fēn)的分(fēn)子結構[5]和體(tǐ)外功能(néng)指标[6]。本研究将通過大鼠試驗研究該産(chǎn)品對切除卵巢後老齡雌性大鼠骨密度的影響及對骨質(zhì)疏松的預防作(zuò)用(yòng)。
1. 材料及方法
1.1CPP及大鼠飼料
CPP是用(yòng)選擇沉澱法從酪蛋白的胰酶水解液中(zhōng)分(fēn)離得到，其中(zhōng)總氮、鈣及磷的含量分(fēn)别為(wèi)9.07%、6.00%和2.94%，水分(fēn)含量為(wèi)17.0%。大鼠基礎飼料的主要組成（%）為(wèi)：小(xiǎo)麥粉30、豆餅粉30、玉米粉30、魚粉5.0、骨粉1.5、脫脂奶粉1.6、魚肝油1.0、食鹽0.5.試驗組飼料由基礎飼料添加8%的CPP制成。
1.2 試驗大鼠卵巢切除及飼養
試驗大鼠為(wèi)SD品系，11m齡時自浙江實驗動物(wù)中(zhōng)心購(gòu)入。18隻大鼠随機分(fēn)成3組，每隻鼠分(fēn)别标記，單籠飼養。飼養室溫度（20~25）℃，試驗大鼠自由進食基礎飼料和自來水。至13m齡時，對其中(zhōng)兩組實施卵巢切除術，另一組施行僞手術（造成同樣的創口，但不切除卵巢）。手術前用(yòng)65mg/kg bw的硫噴妥鈉對大鼠施行麻醉，切下的卵巢分(fēn)别放入裝(zhuāng)有(yǒu)福爾馬林溶液的小(xiǎo)瓶，送病理(lǐ)科(kē)檢驗卵巢是否切除完整。
手術後恢複飼養1m，之後将一組切除卵巢的大鼠作(zuò)為(wèi)對照1組(Sham），飼喂基礎飼料。一次給入一星期的飼料（200~220g），下次補充飼料前對所剩飼料稱重，精(jīng)确記錄每隻鼠的飼料消耗量。
1.3 骨密度（BMD）和骨礦物(wù)質(zhì)含量（BMC）的測定、
測定BMD和BMC之前，先稱重，按55mg/kg bw硫噴妥鈉的劑量對大鼠實施麻醉。麻醉後将大鼠擺成匍匐狀，四肢自然伸展，用(yòng)橡皮膏固定于紙上，在DEXA雙能(néng)X-線(xiàn)骨密度儀（美國(guó)，Norland公(gōng)司）上，對鼠全身進行掃描，掃描結束後，框取鼠全身，鼠頭部或腿部，用(yòng)骨密度儀上配置的數據處理(lǐ)系統計算全身或鼠體(tǐ)不同部位的BMD和BMC。
1.4 磁性激素的測定
在對大鼠施行卵巢切除手術之前和手術後1m時，分(fēn)别從每隻大鼠尾部采集0.5ml血液，用(yòng)放免試劑盒測定血液中(zhōng)雌二醇（E2）、黃體(tǐ)生成素（LH）和促卵泡激素（FSH）的含量。
1.5 統計分(fēn)析
實驗結果用(yòng)
表示，各組間的差異顯著性分(fēn)析用(yòng)DPS數據處理(lǐ)軟件，采用(yòng)Bonferroni檢驗法分(fēn)析。
2. 結果
2.1 磁性激素的測定及卵巢病理(lǐ)檢驗結果
卵巢在卵成熟前分(fēn)泌雌二醇，卵巢切除後血液中(zhōng)雌二醇水平下降，切除卵巢後，黃體(tǐ)生成素和促卵泡激素在血液中(zhōng)的含量都将上升[7]。從測定手術前後血液中(zhōng)三種雌性激素含量的變化，可(kě)以确證卵巢切除術的效果。保證最終試驗結果的可(kě)靠性。由江蘇原子醫(yī)學(xué)研究所附屬江原醫(yī)院檢驗科(kē)完成的三種雌性激素的測定，結果見表1，結合病理(lǐ)科(kē)出具(jù)的檢驗報告可(kě)以肯定，大量的卵巢均被完整切除。
Table 1 Hormines of rats before and after ovariectomy*
Group | Estradiol （E2） （pg/ml） | Luteinizing hormone（LH） (IU/L) | Folicle stimulating hormone （FSH） (IU/L) | |||
Before | After | Before | After | Before | After | |
CPP | 4.71 | 2.31 | 1.51 | 2.44 | 2.40 | 7.02 |
Sham 1 | 6.29 | 2.54 | 1.17 | 2.15 | 1.30 | 6.34 |
Before：before ovariectomy；After： after ovariectomy；* the data is the average of six rats
2.2 大鼠體(tǐ)重的變化
試驗期間三組大鼠的體(tǐ)重變化不大，至試驗結束時，各組大鼠的體(tǐ)重略有(yǒu)上升。T組大鼠體(tǐ)重一直呈上升趨勢，Sham 1 和Sham 2組手術後體(tǐ)重一度呈下降趨勢，術後2m時，體(tǐ)重又(yòu)開始慢慢回升。
2.3 大鼠的骨密度（BMD）和骨礦物(wù)質(zhì)含量（BMC）
在對大鼠施行手術之後4.5m，也即用(yòng)添加CPP的飼料飼喂大鼠3.5m之後，測定了其BMD和BMC。大鼠全身BMD和BMC測定結果見表2。手術後4.5m時，Sham 1組和Sham 2組的BMD和BMC幾乎等同，CPP組的BMD和BMC均比對照組高，統計分(fēn)析表明，CPP組與Sham 1及Sham 2的差異均未達到顯著水平（P>0.05）。
Table 2 BMD and BMC of the whole body of rats ()
Group | n | BMD(mg/cm2) | BMC(g) |
CPP | 6 | 167.3±8.595 | 13.09±2.637 |
Sham 1 | 6 | 161.3±10.88 | 11.38±1.418 |
Sham 2 | 6 | 160.7±5.955 | 11.48±0.938 |
研究表明，骨質(zhì)疏松症常按以下順序發生骨骼損耗：第一步，颌骨、牙槽骨發生骨損，引起支持牙齒的力量下降，造成牙龈松動繼而損壞而掉牙；第二步，脊椎骨骨骼損耗，導緻難于愈合的壓迫性骨折，使病人睡年齡的增長(cháng)而身高降低；第三步，長(cháng)骨骨損發生。因為(wèi)要在颌骨和脊椎骨有(yǒu)骨損時，長(cháng)骨的骨質(zhì)才開始丢失，因此早期的骨質(zhì)疏松症用(yòng)X射線(xiàn)是難于确診的，但通過X射線(xiàn)照射颌骨能(néng)迅速地診斷早期的骨質(zhì)疏松症[8]。鑒于此，我們對大鼠的頭部及左、右腿的BMD和BMC分(fēn)别進行了就算，結果見表3.
Table 2 BMD and BMC of heads and legs of rats ()
Group | Heads | Legs | ||
BMD(mg/cm2) | BMC(g) | BMD(mg/cm2) | BMC(g) | |
CPP | 282.0±11.94a | 2.910±0.2930a | 143.8±6.46a | 1.113±0.2080a |
Sham 1 | 259.7±17.69b | 2.600±0.2231a | 144.5±11.30a | 1.029±0.1485a |
Sham 2 | 265.2±11.75ab | 2.613±0.2054a | 143.9±6.09a | 1.105±0.05297a |
Note:data in the same column not sharing same superscript are significantly different(p<0.05)
從表3中(zhōng)看出，CPP組頭部的BMD明顯高于Sham 1組(p<0.05)，但CPP組頭部的BMD與Sham 2之間及CPP組頭部的BMC與兩對照之間的差異均未達到顯著水平。而大鼠腿部的BMD和BMC則更未表現出差異。
3. 讨論
據Hodgkinsin[7]報道，單純性卵巢切除（不輔以其它引發骨質(zhì)疏松的因素），手術組骨量減少至比對照組顯著降低（顯著水平為(wèi)p<0.05）需30w，即7m多(duō)。Kalu等[9]也報道，切除卵巢的老齡大鼠，6m後，股骨和腰椎的骨密度才能(néng)顯著降低。為(wèi)了模拟攝取正常膳食的絕經婦女，本研究采用(yòng)單純性卵巢切除來誘發骨質(zhì)疏松，由于時間及其它方面條件的限制，本試驗未能(néng)繼續至單純性卵巢切除誘使骨密度顯著降低所需的時間期限（7m左右）。因此，除了CPP處理(lǐ)組與切除卵巢的對照組（Sham 1）的頭部骨密度差異達到顯著水平外，大鼠全身及腿部的骨密度及骨礦物(wù)質(zhì)含量與Sham 之間及Sham 1和Sham 2組之間骨密度的差異均未達到顯著水平。但由于動物(wù)骨損的發生有(yǒu)前述特定的規律，第一步是發生在頭部，之後才是脊椎和長(cháng)骨，因此在頭部已表現出明顯的骨損後，将試驗持續進行下去，腿部及全身表現明顯骨損的可(kě)能(néng)性很(hěn)大，若能(néng)輔以低鈣飼料，則将會加快這一進程。就目前取得的結果分(fēn)析，已可(kě)以肯定CPP對延緩切除卵巢的老齡磁性大鼠骨質(zhì)丢失有(yǒu)一定效果。
關鍵詞：酪蛋白磷酸肽；老齡大鼠；骨密度；骨質(zhì)疏松
Key words: casein phosphopeptides(CPP); aged rats; bone mineral density(BMD); osteoporosis
參考文(wén)獻
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[4] 張亞非，周羽并，吳鳳蘭，等，酪蛋白磷酸肽（CPP）對大鼠鈣吸收利用(yòng)的影響[J].營養學(xué)報，1994，16:73-77
[5] 馮鳳琴，王博誠，倪莉，等，酪蛋白磷酸肽分(fēn)子結構的鑒定[J].無錫輕大學(xué)學(xué)報，1999,18:33-37.
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[8] [美】AH恩斯明格.ME恩斯明格，JE康蘭德(dé)，等，疾病與飲食[M].北京：農業出版社，1989.176-177.
[9] Kalu DK,Liu CC,Hardin R,et al.The afed rat model of ovarian hormone deficiency bone loss[J].Endocrinology,1989,124:7-16.
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