小(xiǎo)小(xiǎo)肽|小(xiǎo)麥肽的抗氧化與抗疲勞作(zuò)用(yòng)研究——杭州康源食品科(kē)技(jì )有(yǒu)限公(gōng)司

小(xiǎo)麥肽的抗氧化與抗疲勞作(zuò)用(yòng)研究

王倩倩1，杜鵑2，陳鳴2，馮鳳琴1,*

(1.浙江大學(xué)生物(wù)系統工(gōng)程與食品科(kē)學(xué)學(xué)院，浙江杭州310012；

2.杭州康源食品科(kē)技(jì )有(yǒu)限公(gōng)司，浙江杭州310012)

摘要：目的：探讨小(xiǎo)麥肽的體(tǐ)外抗氧化活性和體(tǐ)内抗疲勞作(zuò)用(yòng)。方法：通過H2O2誘導小(xiǎo)鼠成纖維細胞L929構建氧化應激損傷模型，測定損傷後L929細胞的存活率、乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase,LDH)、超氧化物(wù)歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物(wù)(glutathioneperoxidedismutase,GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量，從細胞水平評價小(xiǎo)麥肽的抗氧化作(zuò)用(yòng)。然後通過力竭遊泳和自由泳實驗，測定力竭遊泳時間、乳酸(lacticacid,LA)、尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)和肌糖原(muscleglycogen,MG)含量、SOD和GSH-Px)活力以及MDA含量，來評價小(xiǎo)麥肽的體(tǐ)内抗疲勞和抗氧化作(zuò)用(yòng)。結果：小(xiǎo)麥肽濃度在0.4、0.8mg/mL時對L929細胞的H2O2損傷有(yǒu)極顯著的保護作(zuò)用(yòng)；與模型組相比，小(xiǎo)麥肽濃度為(wèi)0.6和0.8mg/mL時的LDH活力分(fēn)别顯著下降了20.79%和19.67%、SOD活力分(fēn)别顯著和極顯著的提高了83.21%和95.19%、GSH-Px活力分(fēn)别提高了28.69%和32.14%，MDA含量分(fēn)别顯著下降了25.91%和26.99%。體(tǐ)内抗疲勞實驗表明，與對照組相比，2個劑量組的小(xiǎo)鼠力竭遊泳時間分(fēn)别顯著延長(cháng)了72.93%和91.73%，LA含量分(fēn)别極顯著下降了24.65%和25.16%、BUN含量分(fēn)别極顯著和顯著下降了19.74%和17.78%，MG含量分(fēn)别極顯著提高了48.63%和56.85%；體(tǐ)内抗氧化結果表明，2個劑量組的SOD和GSH-Px活力分(fēn)别極顯著提高了20.54%、25.91%和29.79%、35.77%，MDA含量分(fēn)别極顯著下降了23.08%和21.46%。Pearson相關性分(fēn)析表明小(xiǎo)麥肽的體(tǐ)内抗疲勞與抗氧化作(zuò)用(yòng)高度相關。結論：小(xiǎo)麥肽具(jù)有(yǒu)顯著的抗氧化和緩解疲勞作(zuò)用(yòng)，且抗氧化活性與抗疲勞作(zuò)用(yòng)高度相關。

關鍵詞：小(xiǎo)麥肽，小(xiǎo)鼠，抗氧化，抗疲勞，自由基

StudyontheAntioxidantand

Anti-fatigueEffectofWheatPeptides

WANGQian-qian1,DUJuan2,CHENMing2,FENGFeng-qin1,*

(1.CollegeofBiosystemsEngineeringandFoodScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310012,China;

2.HangzhouKangyuanFoodScience&TechnologyCo.,Ltd,Hangzhou310012,China)

Abstract: Objective: To investigate the in vitro antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effect of wheat peptides. Methods: The oxidative stress model was established by treating L929 cells with H2O2. Then the cell survival rate, the activity of lactic dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxide dismutase (GSH-Px), and the content of malondialdehyde (MDA) were measured to evaluate the antioxidant activity of wheat peptides in vitro. In addition, the exhaustive swimming and freestyle swimming test was assessed. Then the exhaustive swimming time, the content of lactic acid (LA), blood urea nitrogen (BUN), muscle glycogen (MG) and MDA, the activity of SOD and GSH-Px were measured to studied the anti-fatigue and antioxidant of wheat peptides in vivo. Results: The wheat peptides in the concentration range from 0.4 to 0.8 mg/mL could protect L929 cells against H2O2-induced oxidative damaged as indicated by highly significantly increased the survival rate. Compared to the model group, the activity of LDH of the wheat peptides at 0.6 and 0.8 mg/mL was significantly decreased by 20.79% and 19.67%, the activity of SOD was highly significantly and significantly increased by 83.21% and 95.19%, the activity of GSH-Px was increased by 28.69% and 32.14%, and the content of MDA was significantly decreased by 25.91% and 26.99%. Compared with the control group, the exhaustive swimming time of the wheat peptides at 2 and 8 mg/mL was significantly increased by 72.93% and 91.73%, the content of LA was significantly decreased by 24.65% and 25.16%, the content of BUN was highly significantly and significantly decreased by 19.74% and 17.78%, and the content of MG was highly significantly increased by 48.63% and 56.85%. At the same time, the activity of SOD and GSH-Px was highly significantly increased by 20.54% and 25.91%, 29.79% and 35.77%, and the content of MDA was highly significantly decreased by 23.08% and 21.46%. Pearson correlation analysis showed that the antifatigue effect of wheat peptides was highly correlated with its antioxidant activity. Conclusion: Wheat peptide had significant antioxidant activity and anti-fatigue effect, and the anti-fatigue effect of wheat peptide was correlated with antioxidant activity.

Key words: wheat peptides; mice; antioxidant; anti-fatigue; free radical

中(zhōng)圖分(fēn)類号：TS201.4文(wén)獻标志(zhì)碼：Adoi:10.13386/j.issn1002-0306.2020100066

近年來，随着生活節奏的加快和社會壓力的增大，大部分(fēn)人都處于亞健康的狀态，因此越來越多(duō)人開始通過各種運動方式來提升自己的身體(tǐ)機能(néng)。在正常情況下，合理(lǐ)的體(tǐ)育鍛煉有(yǒu)助于身體(tǐ)更好的發揮功能(néng)。但由于自身條件的不同以及運動量的不合理(lǐ)，他(tā)們經常會因為(wèi)過度的運動導緻身體(tǐ)的不适，引起身體(tǐ)的疲勞，從而影響工(gōng)作(zuò)效率，甚至造成各種運動性損傷，危及損害身體(tǐ)健康^[1]。關于運動性疲勞的機制有(yǒu)幾種學(xué)說，包括耗竭學(xué)說、阻塞學(xué)說、自由基學(xué)說、内環境失調學(xué)說、保護性抑制學(xué)說和突變學(xué)說^[2]。其中(zhōng)自由基學(xué)說認為(wèi)機體(tǐ)在高強度或長(cháng)時間運動時會産(chǎn)生過量的自由基，如羟基自由基和超氧陰離子自由基，過多(duō)的自由基會破壞體(tǐ)内氧化和抗氧化平衡，引起肝髒和骨骼肌線(xiàn)粒體(tǐ)的脂質(zhì)過氧化損傷，最終導緻疲勞^[3]。因此保護機體(tǐ)不受氧化傷害是預防疲勞的有(yǒu)效方法^[4-5]。外源性抗氧化物(wù)質(zhì)能(néng)與内源性自由基相互作(zuò)用(yòng)，減少機體(tǐ)氧化損傷、增強機體(tǐ)抗氧化防禦能(néng)力、減少疲勞産(chǎn)生。近年來，營養幹預特别是多(duō)肽類營養保健品受到越來越多(duō)研究者的關注，大量研究表明多(duō)肽在緩解疲勞方面是安(ān)全有(yǒu)效的^[6-8]。與蛋白質(zhì)相比，多(duō)肽類補充劑能(néng)夠被機體(tǐ)更快更好地吸收，且能(néng)夠加快氨基酸、蛋白質(zhì)和葡萄糖的利用(yòng)速率^[9]。

小(xiǎo)麥肽是小(xiǎo)麥蛋白經過酶解得到的結構片段，其氨基酸含量均衡，具(jù)有(yǒu)多(duō)種功能(néng)活性，如抗氧化^[10-11]、解酒^[12]、免疫調節^[13-14]、降血糖^[15]、保護腸粘膜^[16]、促進胃粘膜修複^[17]等。研究表明酶解産(chǎn)物(wù)的氨基酸組成可(kě)能(néng)與其生物(wù)活性有(yǒu)關^[18]。小(xiǎo)麥肽氨基酸組成中(zhōng)谷氨酸的含量最高，而谷氨酸中(zhōng)谷氨酰胺含量豐富^[19]。谷氨酸對神經系統具(jù)有(yǒu)積極的作(zuò)用(yòng)并且在運動過程中(zhōng)是有(yǒu)用(yòng)的^[20]，谷氨酰胺是谷胱甘肽合成的重要底物(wù)，在機體(tǐ)的抗氧化體(tǐ)系中(zhōng)具(jù)有(yǒu)重要作(zuò)用(yòng)。運動性疲勞的産(chǎn)生和氧化應激之間存在着很(hěn)大的關系，已經成為(wèi)抗疲勞領域研究的熱點。但目前關于小(xiǎo)麥肽的功能(néng)活性研究主要集中(zhōng)在小(xiǎo)麥肽的體(tǐ)外抗氧化方面，而對體(tǐ)内抗疲勞的研究較少。另外小(xiǎo)麥肽作(zuò)為(wèi)一種新(xīn)的食品原料來源尚未得到廣泛應用(yòng)。因此，我們以小(xiǎo)麥肽為(wèi)研究對象，利用(yòng)H2O2誘導小(xiǎo)鼠成纖維細胞L929氧化損傷，從細胞水平評價小(xiǎo)麥肽的體(tǐ)外抗氧化活性，然後通過給予小(xiǎo)鼠灌胃小(xiǎo)麥肽30天，測定小(xiǎo)鼠力竭遊泳時間和與疲勞相關的生化指标，探讨小(xiǎo)麥肽的抗疲勞作(zuò)用(yòng)，并探求體(tǐ)内抗氧化活性和抗疲勞作(zuò)用(yòng)之間的相關性，從氧化應激的角度來解釋小(xiǎo)麥肽的抗疲勞機制，以期為(wèi)小(xiǎo)麥肽作(zuò)為(wèi)功能(néng)性食品基料提供數據支持。

1材料與方法

1.1材料與儀器

小(xiǎo)鼠成纖維細胞L929購(gòu)買于中(zhōng)科(kē)院上海細胞庫，L929細胞用(yòng)RPMI1640培養基，含10%胎牛血清和1%雙抗，在37℃、5%CO2的條件下培養，當細胞融合至80%以上後，進行傳代。SPF級ICR雄性小(xiǎo)鼠64隻，體(tǐ)重約(20±2)g，實驗動物(wù)許可(kě)證編号為(wèi)SYXK(浙)2018-0012，由浙江中(zhōng)醫(yī)藥大學(xué)實驗動物(wù)中(zhōng)心提供和飼養，自由進食标準顆粒飼料及飲水，保持環境溫度(25±2)℃，光照周期12h:12h條件下适應性飼養一周後使用(yòng)。乳清蛋白粉購(gòu)于市場；胎牛血清浙江天杭生物(wù)科(kē)技(jì )股份有(yǒu)限公(gōng)司；RPMI1640培養基、雙抗(青黴素、鏈黴素)、0.25%胰酶上海源培生物(wù)科(kē)技(jì )股份有(yǒu)限公(gōng)司；乳酸(LA)、尿素氮(BUN)、肌糖原(MG)、超氧化物(wù)歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物(wù)酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒南京建成生物(wù)工(gōng)程研究所；其餘化學(xué)試劑均為(wèi)國(guó)産(chǎn)分(fēn)析純。

HH-6數顯恒溫水浴鍋常州澳華儀器有(yǒu)限公(gōng)司；PB-10pH計、BSA224S電(diàn)子分(fēn)析天平賽多(duō)利斯科(kē)學(xué)儀器有(yǒu)限公(gōng)司；752型紫外-可(kě)見分(fēn)光光度計上海光譜儀器有(yǒu)限公(gōng)司；Ultimate3000高效液相色譜儀美國(guó)賽默飛世爾科(kē)技(jì )有(yǒu)限公(gōng)司；HC-3018R高速冷凍離心機安(ān)徽中(zhōng)佳科(kē)學(xué)儀器有(yǒu)限公(gōng)司；InfiniteM200Pro酶标儀瑞士帝肯集團公(gōng)司；MCO-170AICUVDL-PCCO2細胞培養箱日本松下電(diàn)器産(chǎn)業株式會社；DM500光學(xué)顯微鏡徕卡顯微系統貿易有(yǒu)限公(gōng)司。

1.2實驗方法

1.2.1小(xiǎo)麥肽的制備稱取一定量的谷朊粉，調節料液的pH至8.0，添加0.4%蛋白酶，于50℃下酶解1.5h後置于沸水浴中(zhōng)滅酶30min，經濃縮、噴霧幹燥制得小(xiǎo)麥肽。

1.2.2小(xiǎo)麥肽特性的測定

1.2.2.1氨基酸組成采用(yòng)異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法[21]測定小(xiǎo)麥肽的氨基酸組成。樣品溶解于6mol/LHCl，然後于110℃水解24h後冷卻，取6μL水解液置于離心管中(zhōng)，氮氣吹幹後加入10μL再幹燥液，吹幹後加入20μL衍生溶液混勻，室溫靜置20min後再次氮氣吹幹，加入50μL流動相B，混勻後加入450μL流動相A，過膜上機。

色譜條件：色譜柱為(wèi)WelchAQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相A為(wèi)0.1mol/L乙酸鈉溶液(含3%乙腈和0.1%三乙胺)，流動相B為(wèi)80%乙腈；流速1.0mL/min；柱溫38℃；進樣量20μL；檢測波長(cháng)254nm。

1.2.2.2相對分(fēn)子質(zhì)量分(fēn)布采用(yòng)凝膠過濾色譜測定小(xiǎo)麥肽的相對分(fēn)子質(zhì)量分(fēn)布^[22]。色譜條件：色譜柱為(wèi)TSKgelG2000SWXL(300mm×7.8mm，5μm)；流動相為(wèi)乙腈-超純水-三氟乙酸(體(tǐ)積比45:55:0.1)；流速0.5mL/min；柱溫30℃；進樣量20μL；檢測波長(cháng)220nm。

1.2.3體(tǐ)外抗氧化活性的測定

1.2.3.1細胞損傷模型的建立選擇對數生長(cháng)期的L929細胞，稀釋細胞個數為(wèi)5×10⁴個/mL，接種于96孔闆中(zhōng)，每孔接種100µL，置于37℃、5%CO2培養箱中(zhōng)培養。24h後，棄去舊培養基，然後進行分(fēn)組：空白組不加細胞，隻加培養基；對照組加入不含H2O2的培養基，實驗組加入不同濃度的H2O2(40、80、120、160、200、250、300、350µmol/L)。24h後，用(yòng)CCK-8法檢測細胞存活情況，通過公(gōng)式(1)計算細胞存活率。

1.2.3.2小(xiǎo)麥肽對L929細胞生長(cháng)的影響選擇對數生長(cháng)期的L929細胞，稀釋細胞個數為(wèi)5×10⁴個/mL，接種于96孔闆中(zhōng)，每孔接種100µL，置于37℃、5%CO2培養箱中(zhōng)培養24h。24h後，棄去舊培養基，然後進行分(fēn)組：空白組不加細胞，隻加培養基；對照組加入不含樣品的培養基，實驗組加入不同濃度的小(xiǎo)麥肽(0.2、0.4、0.8、1.6mg/mL)。24h後，用(yòng)CCK-8法檢測細胞存活情況，通過公(gōng)式(1)計算細胞存活率。

1.2.3.3小(xiǎo)麥肽對H2O2誘導L929細胞損傷的保護作(zuò)用(yòng)選擇對數生長(cháng)期的L929細胞，稀釋細胞個數為(wèi)5×10⁴個/mL，接種于96孔闆中(zhōng)，每孔接種100µL，置于37℃、5%CO2培養箱中(zhōng)培養。24h後，棄去舊培養基，然後進行分(fēn)組：實驗組加入不同濃度的小(xiǎo)麥肽(0.2、0.4、0.6、0.8mg/mL)；正常對照組和H2O2損傷組加入不含樣品的培養基。培養24h後棄去舊培養基，H2O2損傷組和樣品組加入300µmol/L的H2O2，正常組加入不含H2O2的完全培養基，作(zuò)用(yòng)24h後，用(yòng)CCK-8法檢測細胞存活情況，通過公(gōng)式(1)計算細胞存活率^[23]。

1.2.3.4抗氧化指标測定選擇對數生長(cháng)期的L929細胞，稀釋細胞個數為(wèi)5×10⁴個/mL，接種于6孔闆中(zhōng)，每孔接種2mL。培養24h後進行分(fēn)組：正常對照組、H2O2模型組、不同濃度小(xiǎo)麥肽組(0.4、0.6、0.8mg/mL)。細胞經過不同樣品和H2O2處理(lǐ)後，收集細胞和培養液進行各指标的測定。分(fēn)别用(yòng)試劑盒提供的方法測定上清液中(zhōng)LDH活力，細胞内SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量。

1.2.4抗疲勞實驗

1.2.4.1動物(wù)分(fēn)組及給藥雄性ICR小(xiǎo)鼠64隻，體(tǐ)重約(20±2)g，按照體(tǐ)重随機分(fēn)為(wèi)4組，分(fēn)别為(wèi)對照組(蒸餾水，同等劑量)、陽性組(乳清蛋白，2mg/g/d)、小(xiǎo)麥肽低劑量組(2mg/g/d)、小(xiǎo)麥肽高劑量組(8mg/g/d)，每組16隻，根據小(xiǎo)鼠重量給予不同劑量的受試物(wù)，灌胃量按0.1mL/10g，每日1次，連續30d，灌胃期間自由取食和飲水。灌胃30d後，将每組的16隻小(xiǎo)鼠随機分(fēn)為(wèi)2個亞組(每個亞組8隻小(xiǎo)鼠)，即A組和B組，A組小(xiǎo)鼠用(yòng)于力竭遊泳實驗，B組小(xiǎo)鼠用(yòng)于自由泳實驗測定抗疲勞相關生化指标。具(jù)體(tǐ)的動物(wù)實驗設計如表1所示。

表1動物(wù)實驗設計

Table1Experimentaldesignofanimals

1.2.4.2力竭遊泳實驗末次灌胃30min後，将每組中(zhōng)的A組小(xiǎo)鼠用(yòng)肥皂水洗去其體(tǐ)表油脂，然後在小(xiǎo)鼠尾根部負荷5%體(tǐ)重的鉛絲，放入水溫25℃、水深約30cm的遊泳箱中(zhōng)遊泳。遊泳期間若有(yǒu)躬腰停止、懸浮休息者，用(yòng)玻璃棒攪動附近水流迫使其不停運動。用(yòng)秒(miǎo)表記錄自遊泳開始至小(xiǎo)鼠頭部全部沉入水中(zhōng)7s不能(néng)浮出水面的時間，該時間作(zuò)為(wèi)小(xiǎo)鼠的力竭遊泳時間。

1.2.4.3疲勞相關生化指标測定末次灌胃30min後，将每個實驗組中(zhōng)的B組小(xiǎo)鼠眼球取血，靜置15min後，離心取上清液，-80℃保存備用(yòng)。然後将采血後的小(xiǎo)鼠立即處死，取出肝髒和後腿肌肉，按照1:9的比例加入相應體(tǐ)積的生理(lǐ)鹽水，磨勻漿後得到10%的組織勻漿液，-80℃保存備用(yòng)。分(fēn)别用(yòng)試劑盒提供的方法測定小(xiǎo)鼠血清中(zhōng)LA和BUN含量、肌肉中(zhōng)MG含量、肝髒中(zhōng)MDA含量、SOD和GSH-Px活力。

1.3數據處理(lǐ)

采用(yòng)SPSS19.0軟件進行統計學(xué)處理(lǐ)，采用(yòng)單因素方差分(fēn)析比較組間差異，結果以均值±标準差表示，數據圖表用(yòng)GraphPadPrism8.0軟件制作(zuò)。

2.1氨基酸組成和相對分(fēn)子質(zhì)量分(fēn)布

圖1小(xiǎo)麥肽的相對分(fēn)子質(zhì)量分(fēn)布

Fig.1Relativemolecularweightdistributionofwheatpeptides

肽的生物(wù)活性與其氨基酸組成相關。由表2可(kě)知，小(xiǎo)麥肽含有(yǒu)18種肽的生物(wù)活性與其氨基酸組成相關。由表2可(kě)知，小(xiǎo)麥肽含有(yǒu)18種氨基酸，總量為(wèi)76.66%，表明小(xiǎo)麥肽含有(yǒu)豐富的氨基酸組成。其中(zhōng)谷氨酰胺和脯氨酸是最主要的氨基酸，含量分(fēn)别為(wèi)22.91%和9.92%。而谷氨酰胺是一種重要的具(jù)有(yǒu)特殊營養作(zuò)用(yòng)的條件性必需氨基酸及腸道必需氨基酸，它在保護細胞膜的完整性、維持細胞活力及降低細胞氧化損傷方面具(jù)有(yǒu)積極的作(zuò)用(yòng)^[24]。半胱氨酸含有(yǒu)可(kě)電(diàn)離的硫醇基團，能(néng)夠清除自由基并結合金屬離子^[25]；組氨酸結構上含有(yǒu)咪唑環，可(kě)以與金屬離子和活性氧結合^[26]；甲硫氨酸含有(yǒu)硫醚基團，對特定氧化劑有(yǒu)反應^[27]；酪氨酸含有(yǒu)酚羟基，通過提供氫原子來清除活性氧^[28]。因此，以上4種氨基酸被普遍認為(wèi)具(jù)有(yǒu)抗氧化活性^[29]。另外，亮氨酸、異亮氨酸和缬氨酸這類支鏈氨基酸不僅可(kě)以明顯改善運動能(néng)力，延緩運動過程中(zhōng)肌肉蛋白質(zhì)的分(fēn)解代謝(xiè)，而且還能(néng)減少運動後乳酸的積累，從而延緩血乳酸引起的疲勞。由表2可(kě)知，小(xiǎo)麥肽中(zhōng)具(jù)有(yǒu)抗氧化活性的半胱氨酸、組氨酸、甲硫氨酸和酪氨酸這4種氨基酸含量為(wèi)6.31%。同時，小(xiǎo)麥肽中(zhōng)亮氨酸、異亮氨酸和缬氨酸這3種支鏈氨基酸的含量較高為(wèi)13.22%。因此，小(xiǎo)麥肽富含抗氧化與抗疲勞活性的氨基酸，推測其可(kě)能(néng)具(jù)有(yǒu)一定的抗氧化與抗疲勞的潛能(néng)。

除了氨基酸組成，肽的生物(wù)活性也取決于其相對分(fēn)子質(zhì)量的分(fēn)布，分(fēn)子量小(xiǎo)于3000Da的肽被認為(wèi)比分(fēn)子量大于3000Da的肽具(jù)有(yǒu)更好的抗氧化活性，這種較好的活性可(kě)能(néng)是由于分(fēn)子量小(xiǎo)的肽段具(jù)有(yǒu)高活性、易吸收和低毒性^[30]。由表3可(kě)知，小(xiǎo)麥肽相對分(fēn)子質(zhì)量小(xiǎo)于3000Da的部分(fēn)占70.56%，推測其具(jù)有(yǒu)一定的抗氧化效果。

2.2體(tǐ)外抗氧化

2.2.1小(xiǎo)麥肽對H2O2誘導L929細胞損傷的保護作(zuò)用(yòng)

圖2小(xiǎo)麥肽對L929細胞氧化損傷的保護作(zuò)用(yòng)

Fig.2ProtectiveeffectofwheatpeptidesagainstH2O2inducedoxidativedamageinL929cells

注：與對照組相比，*代表差異顯著P＜0.05，**代表差異極顯著P＜0.01；與模型組相比，#代表差異顯著P＜0.05，

##代表差異極顯著P＜0.01，圖3同。

通過H2O2處理(lǐ)小(xiǎo)鼠成纖維細胞L929制備氧化應激損傷模型，來探讨小(xiǎo)麥肽的體(tǐ)外抗氧化活性。如圖2A所示，與對照組相比，當H2O2濃度為(wèi)300µmol/L作(zuò)用(yòng)24h時，細胞存活率為(wèi)52.39%，因此選擇該濃度的H2O2進行下一步實驗。如圖2B所示，與對照組相比，濃度在0.2~0.8mg/mL範圍内的小(xiǎo)麥肽對L929細胞均具(jù)有(yǒu)增殖作(zuò)用(yòng)，濃度為(wèi)0.4mg/mL時對細胞的增殖作(zuò)用(yòng)最強，且差異極顯著(P＜0.01)。當濃度大于0.8mg/mL時，小(xiǎo)麥肽對L929細胞的增殖有(yǒu)一定的抑制作(zuò)用(yòng)。因此我們選擇濃度為(wèi)0.2~0.8mg/mL的小(xiǎo)麥肽進行下一步實驗。小(xiǎo)麥肽對L929細胞氧化損傷的保護作(zuò)用(yòng)結果如圖2C所示。與模型組相比，在H2O2損傷前24h加入0.2~0.8mg/mL的小(xiǎo)麥肽均能(néng)提高L929細胞的存活率，且随着濃度的升高，細胞存活率随之增加。當小(xiǎo)麥肽濃度為(wèi)0.6mg/mL時，對L929細胞的保護作(zuò)用(yòng)最顯著(P＜0.01)，此時細胞存活率比模型組的提高了45.62%。綜合兩組實驗結果表明小(xiǎo)麥肽濃度為(wèi)0.4~0.8mg/mL時對H2O2誘導L929細胞氧化損傷的保護作(zuò)用(yòng)較顯著(P＜0.01)。

2.2.2小(xiǎo)麥肽對H2O2誘導L929細胞損傷的抗氧化水平的影響正常細胞經由H2O2處理(lǐ)後，細胞膜被破壞從而導緻細胞内的LDH釋放。因此，上清液LDH活力的高低可(kě)反映出細胞的損傷程度。由圖3A可(kě)知，L929細胞經H2O2損傷後細胞培養液中(zhōng)LDH活力極顯著升高了53.10%(P＜0.01)，說明模型建立成功。與模型組相比，小(xiǎo)麥肽濃度為(wèi)0.4、0.6和0.8mg/mL時LDH的活力分(fēn)别減少了7.20%、20.79%和19.67%，且濃度在0.6mg/mL和0.8mg/mL時差異達到顯著(P＜0.05)。SOD和GSH-Px是機體(tǐ)内主要的抗氧化酶，SOD催化活性氧分(fēn)解生成H2O2和O2，GSH-Px催化H2O2分(fēn)解生成H2O和O2，它們能(néng)直接反應機體(tǐ)的抗氧化水平。而MDA是自由基引起脂質(zhì)過氧化的主要産(chǎn)物(wù)之一，可(kě)間接顯示機體(tǐ)清除氧化産(chǎn)物(wù)能(néng)力和抗氧化活性[31]。由圖3B和圖3C可(kě)知，與模型組相比，小(xiǎo)麥肽濃度為(wèi)0.4、0.6和0.8mg/mL時SOD活力提高了23.55%、83.21%和95.91%，且在濃度為(wèi)0.6mg/mL和0.8mg/mL時差異達到顯著(P＜0.05)和極顯著(P＜0.01)；同時GSH-Px活力提高了11.38%、28.69%和32.14%，但差異均不顯著(P＞0.05)。由圖3D可(kě)知，3個濃度的小(xiǎo)麥肽使得細胞内的MDA含量降低了10.52%、25.91%和26.99%，且在濃度為(wèi)0.6mg/mL和0.8mg/mL時差異達到顯著(P＜0.05)。體(tǐ)外抗氧化實驗表明小(xiǎo)麥肽具(jù)有(yǒu)抑制體(tǐ)内氧化應激的潛力。

圖3小(xiǎo)麥肽對L929細胞氧化損傷LDH、SOD、GSH-Px和MDA水平的影響

Fig.3EffectofwheatpeptidesagainstH2O2inducedoxidativedamageinL929cellsontheSOD,GSH-Px,MDAandLDH

2.3.1體(tǐ)重變化由表4可(kě)知，在實驗期間，各樣品組與對照組小(xiǎo)鼠的體(tǐ)重均有(yǒu)所增加，但體(tǐ)重變化無顯著性差異。灌胃期間，小(xiǎo)鼠無不良反應，體(tǐ)質(zhì)量增加正常，精(jīng)神狀态良好，未發現異常或者死亡現象，表明灌胃小(xiǎo)麥肽并不會影響小(xiǎo)鼠的正常生長(cháng)，對小(xiǎo)鼠無毒副作(zuò)用(yòng)。

2.3.2小(xiǎo)麥肽對小(xiǎo)鼠力竭遊泳時間和抗疲勞指标的影響

圖4小(xiǎo)麥肽對小(xiǎo)鼠力竭遊泳時間、乳酸、尿素氮和肌糖原水平的影響

Fig.4Effectofwheatpeptidesontheexhaustiveswimmingtime,LA,BUNandMG

注：與對照組相比，*代表差異顯著P＜0.05，**代表差異極顯著P＜0.01，圖5同。

力竭遊泳時間是評價抗疲勞能(néng)力的一種實驗模型，它能(néng)夠很(hěn)好地評價小(xiǎo)鼠的疲勞耐受能(néng)力，再現性較高^[32]。由圖4A可(kě)知，小(xiǎo)麥肽低劑量組、高劑量組和乳清蛋白組小(xiǎo)鼠的力竭遊泳時間較對照組均有(yǒu)極顯著差異(P＜0.01)，分(fēn)别延長(cháng)了72.93%、91.73%和64.66%，且高劑量組與乳清蛋白組有(yǒu)顯著差異(P＜0.05)。另外，随着小(xiǎo)麥肽劑量的增加，其力竭遊泳時間也随着延長(cháng)，表明在一定範圍内，小(xiǎo)鼠力竭遊泳時間呈劑量依賴性。長(cháng)時間的劇烈運動會增加肌肉的氧氣消耗，導緻機體(tǐ)相對缺氧，此時肌肉中(zhōng)的糖原會被分(fēn)解産(chǎn)生乳酸，為(wèi)機體(tǐ)提供能(néng)量。但大量的乳酸的産(chǎn)生則會影響機體(tǐ)内環境的酸堿平衡，引起肌肉酸痛，導緻肌肉運動能(néng)力的下降。同時為(wèi)了滿足能(néng)量需求，蛋白質(zhì)的代謝(xiè)顯著增加，使肝髒中(zhōng)的尿素水平明顯增加，過量的尿素會在體(tǐ)内積累并對機體(tǐ)造成危害。BUN的含量在一定程度上可(kě)以反映機體(tǐ)的疲勞程度^[33-34]。由圖4B和4C可(kě)知，與對照組相比，小(xiǎo)麥肽低劑量和高劑量組均使得小(xiǎo)鼠肝髒中(zhōng)的LA含量極顯著降低了24.65%(P＜0.01)、25.16%(P＜0.01)，同時BUN含量較對照組也極顯著和顯著降低了19.74%(P＜0.01)、17.78%(P＜0.05)，表明小(xiǎo)麥肽可(kě)加快LA和BUN的清除速度，減少了代謝(xiè)産(chǎn)物(wù)的堆積和體(tǐ)内蛋白質(zhì)和氨基酸的分(fēn)解代謝(xiè)，具(jù)有(yǒu)改善能(néng)量代謝(xiè)，加速疲勞消除的作(zuò)用(yòng)，從而提高了小(xiǎo)鼠的運動耐力。糖原是體(tǐ)内儲存能(néng)量的主要形式之一，能(néng)夠與糖在機體(tǐ)内進行轉化作(zuò)用(yòng)，肌糖原通過無氧酵解的途徑直接将能(néng)量供給肌肉組織[35]。由圖4D可(kě)知，小(xiǎo)麥肽低劑量和高劑量組MG含量比對照組極顯著提高了48.63%(P＜0.01)、56.85%(P＜0.01)。根據《保健食品功能(néng)學(xué)評價程序和檢驗方法》，若1項以上(含1項)的運動實驗和2項以上(含2項)的生化指标為(wèi)陽性，可(kě)判定該受試物(wù)具(jù)有(yǒu)抗疲勞作(zuò)用(yòng)。小(xiǎo)麥肽低劑量和高劑量組的運動指标和3項生化指标均呈陽性，說明小(xiǎo)麥肽通過延長(cháng)小(xiǎo)鼠力竭遊泳時間，降低運動小(xiǎo)鼠血清中(zhōng)乳酸和尿素氮含量，減少運動引起的肌糖原消耗，具(jù)有(yǒu)顯著的抗疲勞作(zuò)用(yòng)。

2.3.3小(xiǎo)麥肽對小(xiǎo)鼠肝髒抗氧化水平的影響

圖5小(xiǎo)麥肽對小(xiǎo)鼠SOD、GSH-Px和MDA水平的影響

Fig.5EffectofwheatpeptidesontheSOD,GSH-PxandMDA

以往的研究表明，劇烈運動過程中(zhōng)消耗大量的能(néng)量，會使氧化系統和抗氧化系統失去平衡，産(chǎn)生過多(duō)的活性氧，如羟基自由基和超氧陰離子自由基，這些自由基極易引起骨骼肌與肝髒線(xiàn)粒體(tǐ)的脂質(zhì)過氧化損傷，從而削弱抗氧化能(néng)力。在劇烈運動中(zhōng)，人體(tǐ)對氧氣的需求會增加，骨骼肌的血流量也會改變。這些變化導緻自由基的産(chǎn)生和肌肉穩态的紊亂，導緻骨骼肌的氧化損傷，随後的炎症反應和細胞因子的産(chǎn)生，進一步導緻肌肉疲勞[36]。因此，清除活性氧可(kě)能(néng)是緩解肌肉疲勞的主要機制之一。由圖5A和5B可(kě)知，與對照組相比，小(xiǎo)麥肽低劑量和高劑量組均使得小(xiǎo)鼠肝髒中(zhōng)的SOD極顯著提高了20.54%(P＜0.01)、25.19%(P＜0.01)，同時GSH-Px活力較對照組也極顯著提高了29.79%(P＜0.01)、35.77%(P＜0.01)；由圖5C可(kě)知，與對照組相比，小(xiǎo)麥肽低劑量和高劑量組均使得小(xiǎo)鼠肝髒中(zhōng)的MDA含量極顯著降低了23.08%(P＜0.01)、21.46%(P＜0.01)。結果表明，小(xiǎo)麥肽能(néng)夠提高小(xiǎo)鼠體(tǐ)内抗氧化酶的活力，清除因運動而産(chǎn)生的自由基，緩解疲勞，具(jù)有(yǒu)較強的體(tǐ)内抗氧化能(néng)力。

2.3.4體(tǐ)内抗氧化和抗疲勞的相關性分(fēn)析我們将體(tǐ)内抗氧化指标和抗疲勞指标進行Pearson相關性分(fēn)析[37]，得到結果如表5所示。從表中(zhōng)可(kě)以看到，各個處理(lǐ)組的SOD活力、GSH-Px活力與小(xiǎo)鼠力竭遊泳時間、MG含量呈正相關，與LA含量、BUN含量呈負相關；MDA含量與小(xiǎo)鼠力竭遊泳時間、MG含量呈負相關，與LA含量、BUN含量呈正相關。結果表明，小(xiǎo)麥肽的抗疲勞活性與其抗氧化活性高度相關。

3結論

本研究通過H2O2處理(lǐ)小(xiǎo)鼠成纖維細胞L929來制備氧化應激損傷模型，從細胞水平評價小(xiǎo)麥肽的體(tǐ)外抗氧化活性，然後通過給予小(xiǎo)鼠灌胃小(xiǎo)麥肽30d，測定小(xiǎo)鼠力竭遊泳時間和與疲勞相關的生化指标，探讨小(xiǎo)麥肽的抗疲勞作(zuò)用(yòng)，并探求體(tǐ)内抗氧化活性和抗疲勞作(zuò)用(yòng)之間的相關性。體(tǐ)外抗氧化結果表明，H2O2損傷導緻L929細胞存活率降低，細胞上清液中(zhōng)LDH漏出量增多(duō)且能(néng)夠顯著造成細胞内抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低及細胞脂質(zhì)過氧化産(chǎn)物(wù)MDA的增加。但當提前加入小(xiǎo)麥肽對樣品進行預保護後，可(kě)通過提高細胞内SOD和GSH-Px活性、減少MDA含量，發揮其抗氧化作(zuò)用(yòng)。體(tǐ)内抗疲勞結果表明小(xiǎo)麥肽通過延長(cháng)小(xiǎo)鼠力竭遊泳時間，降低運動後LA及BUN的水平，增加MG的含量，提高内源性抗氧化酶體(tǐ)系的活力，減緩疲勞的發生。通過對體(tǐ)内抗氧化和抗疲勞相關性分(fēn)析可(kě)知，抗氧化活性與抗疲勞能(néng)力高度正相關，因此後續可(kě)進行與氧化應激相關的信号通路進行驗證。

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